一、簡介：
隨著科學技術的發展，人們需要分離分析的樣品越來越復雜，尤其是多肽、蛋白質類生物樣品的復雜性使得單一模式色譜難以滿足分離分析的要求?；旌夏Ｊ缴V因其獨特的分離性能，可以在一次分離中獲得與多維色譜相當的分離效果，而且可以避免多維色譜系統結構復雜、流動相兼容性差、分析時間長等問題，成為近年來的研究熱點之一。
匯通色譜代理的瑞士進口的ZEOsphere DRP混合模式色譜填料利用反相/離子交換色譜固定相是在硅膠填料表面同時鍵合具有疏水性質的碳鏈和具有離子交換性質的陰離子或陽離子，將疏水作用與靜電作用相結合，使這兩種具有正交性質的分離機理融合。在單次分離中，從而獲得更好的分離選擇性?；旌夏Ｊ浇Y合了反相色譜和離子交換色譜兩者的優點，不僅對無機化合物和氨基酸有很好的分離效果，還可以應用到核酸、多肽和蛋白質、轉運核糖核酸及轉運核糖核酸衍生物的分離中。
混合模式填料
DRP-A DRP-C
二、特點：
與傳統的單一模式色譜相比，混合模式ZEOsphere DRP填料所具備的主要優點可歸納如下：
（1）較高的選擇性。樣品在單一模式分離較差，混合模式情況下可以更好的分離除去雜質；
（2）顯著的高負載容量。負載量比反相色譜要高1-10倍，這可以成為半制備柱和制備色譜柱新的發展方向；
（3）更強的分離效率。可以替代兩個或多個單一模式色譜柱，這樣可以避免材料的浪費和過度消費, 降低了生產成本；
（4）更高的收率。單次分離純度能達到95%以上，收率在70% 以上。
三、技術參數：
| 孔徑 | 粒徑 | 陽離子集團百分比（%） | 陰離子集團百分比（%） | |||||||||
| ZEO Sphere DRP | 120A | 10um | 2.5 | 5 | 7.5 | 10 | 15 | 50 | 5 | 10 | 15 | 50 |
混合色譜固定相在分離樣品時能夠提供多重保留機理，同時可以通過改變流動相中有機相與水相的比例、ｐＨ 值的高低、鹽濃度的大小等多種方法改變分離選擇性，同單一機理的色譜固定相相比，混合色譜固定相選擇性好、載樣量高。由于鍵合了不同數量的強陰離子基團（A）和強陽離子基團（C）, 與傳統色譜方法相比，同一表面上的離子交換功能和疏水作用均有顯著提高其中A10意味著鍵合了10%的強陰離子基團，C10是鍵合了10%強陽離子交換基團。
四、方法開發要點
工作原理：ZEOsphere DRP混合模式色譜填料固定相是在硅膠填料表面同時鍵合具有疏水性質的碳鏈和具有離子交換性質的陰離子或陽離子，將疏水作用與靜電作用相結合，使這兩種具有正交性質的分離機理融合在單次分離中，從而獲得更好的分離選擇性?；旌夏Ｊ浇Y合了反相色譜和離子交換色譜兩者的優點，特別適用于多肽的純化,還可以應用到核酸、蛋白質、轉運核糖核酸及轉運核糖核酸衍生物的分離中。
方法開發注意事項：
（1）在開法方法之前，一般需要確定目標多肽分子量大小以及等電點（pI）等相關信息；
（2）混合填料利用疏水作用與靜電作用相結合，需要根據多肽的性質選擇混合填料類型，以達到最佳分離；
（3）確定好填料類型后，要對緩沖鹽進行篩選，緩沖鹽pH的選擇一般根據以下原則：DRP-A系列緩沖鹽的pH小于目標物的等電點（pI），最佳pH<pI-2；DRP-C系列緩沖鹽的pH最好大于目標物的等電點（pI），最佳pH>pI+2。例如，人胰島素的pI為5.5，DRP-A>5.5-2=3.5,DRP-C>5.5+2=7.5。
（4）分離方法優化如下：
?緩沖鹽的類型以及濃度；原則上，緩沖鹽的濃度要保持一致；
?填料不同類型的選擇以及相同類型不同鍵合基團含量的選擇；
?有機試劑的種類；
（5）多肽粗品純化分離填料的篩選
?先了解多肽的結構，分子量以及等電點等相關信息；
?以多肽的基本信息為基礎，選擇相對應的填料進行純化，如根據pI、疏水性、分子量大小選擇DRP填料的具體類型；
?在粗品穩定的溫度、pH值范圍內，篩選可能的HPLC條件，根據線性放大原理決定制備LC條件；
五、應用案例-利拉魯肽純化
利拉魯肽是一種人胰高糖素樣肽-1（GLP-1）類似物，用于治療糖尿病。分子式為C172H265N43O51，分子量為3751. 20。利拉魯肽的等電點（pI）是4.9，實現所需的由ZEOsphere DRP斥力，建議使用流動相的pH值至少小于兩個單位pI值(4.9 - 2 = 2.9)或者至少大于兩個單位pI值(4.9 + 2 = 6.9)。由于利拉魯肽在酸性條件下不穩定，且樣品在堿性環境中溶解更好，故選擇堿性條件進行分離。
條件優化：色譜柱和緩沖液的篩選
注：其中標記為綠色的為選擇性比較好的，星數越高分離效果越好：
1、良好的選擇性；2、對稱的峰形；3、主峰和雜質實現基線分離
樣品分離：
色譜柱: ZEOsphere DRP 120 C5(10um, 120A, 10 x 250 mm)
流動相:
A: 150mM乙酸銨緩沖鹽:乙腈=90:10（pH8.5）
B: 150mM乙酸銨緩沖鹽:乙腈=50:50（pH8.5）
流速: 4ml/min 進樣量:50ml 儀器: Waters2795/2487
柱溫: RT 樣品: 4mg/ml（溶于A相） 壓力: 800Psi
檢測波長: UV @ 280nm 梯度：0-5-40(35-35-40%B)
組分分析：
色譜柱: MultoHigh Bio C8 200-5(5um, 200A, 4.6 x 250 mm)
流動相:
A: 100mM磷酸二氫銨(pH3.7):乙腈=900:100
B: 乙腈：水=800:200
流速: 1 ml/min 進樣量: 10ul 儀器: Waters2796/2996
柱溫: 35℃ 樣品: 2mg/ml 壓力: 1300Psi
檢測波長: UV @ 280nm 梯度：0-5-35(50-50-80%B)
粗品
組分分析
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